6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(G6PDH)活性测定试剂盒使用说明

发布于:2021-07-28 00:13:41

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6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)活性测定试 (50T/48S)说明书 货号:BC2100 测定意义: 磷酸戊糖途径途径中 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 (G6PDH) 和 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGDH) 依次催化 NADP 生成 NADPH,与能量的*衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外,6PGDH 在逆境生理中具有重要作用。 测定原理: 6PGDH 催化 6-磷酸葡萄糖酸和 NADP 生成 NADPH, NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰, 而 NADP 在 260nm 处有特征吸收峰;通过测定 340nm 吸光度增加速率,计算 6-PGDH 活性。 自备仪器和用品: 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL 石英比色皿和蒸馏水。 试剂组成和配置: 试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。 试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前配制,加入 5 mL 试剂一,混匀。 试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前配制,加入 5 mL 试剂一,混匀。 粗酶液提取: 称约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一,冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心 10min,取上清 液,待测。 测定: 1. 分光光度计预热 30min 以上,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。 2. 试剂一置于 37℃(哺乳动物样本)或者 25℃(其他)水浴预热 30 min 以上。
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3. 空白管:取 1mL 石英比色皿,依次加入 100μL 蒸馏水,100μL 试剂二,700μL 试 剂一,100μL 试剂三,于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化,第 0s 吸光值记为 A1,第 180s 吸光值记为 A2。 4. 测定管:取 1mL 石英比色皿,依次加入 100μL 粗酶液,100μL 试剂二,700μL 试 剂一, 100μL 试剂三, 于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化, 第 10 s 吸光值记为 A3, 第 190s 吸光值记为 A4。 6PGDH 活性计算: 活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1U(U/mg pr) 。 6PGDH 酶活性(U/mg prot) = [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×10 ]÷(Cpr×V 样)÷T = 535.9×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr △A 测定管:A4-A3;△A 空白管:A2-A1;ε:NADPH 摩尔消光系数,6220;d:比色 皿光径,1 cm; V 反总:反应体系总体积,0.001 L;Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL,需 要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;V 样:反应体系中加入粗酶液体 积,0.1 mL;T:反应时间,3 min。 注意事项: (1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在提取当日完成酶活性测定,粗酶液避 免反复冻融; (2)试剂二和试剂三须现配现用,当天未用完试剂保存在 4℃,可保存 1 周。
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